2.檢測熒光信號的步驟有誤。壹般SG法采用72℃延伸時采集，Taqman法則壹般在退火結束時或延伸結束采集信號。
3.引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測其完整性。
4.引物或探針的設計，如探針高於引物的溫度不夠，造成探針未雜交上而產物已延伸的情況。
5.模板量不足。對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
6.模板降解。避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。
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