中科院上海生物化學研究所，上海 200031 余興明
壹、簡述
近代質粒DNA分離純化以從大腸桿菌中分離為代表，鑒於大局桿菌（E.coli）在分子生物學研究中的重要地位，從E.coli中分離純化質控DNA〈Piasmid DNA〉成為近年來超離心技術中壹個重要課題。而質粒DNA的快速分離純化又對超離心設備（超速離心機、轉頭和附屬設備）提出了更高要求。
E.coli是典型的原核細胞生物，由於原核細胞缺乏其核細胞所具有的那種由單位膜組成的可把多種功能組分分隔為專壹化的和局部獨立區域的內膜系統，因而沒有其核細胞所包含的細胞器（核、內質網、高爾基體、線拉體、溶酶體等等）。電鏡顯微照片顯示E.coli有兩個可以區別的內部區域壹壹細胞質和核質，在它們外面圍著壹層較薄的細胞質膜和很厚的細胞壁，在細胞壁外部附著壹些壹端遊離的鞭毛。質粒DNA位於核區，以細絲狀存在，這種細絲狀物在多種情況下是極長的環狀DNA的壹些片斷所折疊起來的聚密體。
針對E.coli的顯微結構待點，在進行超離心分離純化質粒DNA之前的預處理順序是：
E.coli→用溶菌酶去細胞壁→用表面活性劑如SDS、Trit X-100等EE細胞膜→用乙酸鍋使DNA、RNA及蛋白質大部分沈澱(90%以上)。
沈澱物可以在加入TE緩沖液(10m-MTris-HCL lmMEDTA,pH8.0)後分子篩上住去蛋白,去RNA;也可以用超速離心法去蛋白居,去RNA，去級狀DNA或DNA斷片。本文將綜述後壹種方法在近年來的新進展.
二、質粒DNA超速離心分離的最新進展
1、 傳統的分離方法：數年前，由於受設備條件限制，質粒DNA的分離壹般用CsCl平衡等密度離心法，自形成梯度。以10~12ml單管容量為例，用甩平轉頭分離，36.000rpm×60小時，用角式轉頭分離45,OOOrpm×36小時，前者包括加減速在內***用去1.3億轉驅動部壽命，後者也要用去1億轉驅動部壽命，這對當時超速離心機總壽命為100~200億轉來看，無疑每次實驗費用過高，加上CsCl用量多、價格貴等因素，使這類分離純化工作成為非常昂貴的實驗。
2、新進展：
（1）超速垂直管轉頭的離心分離（欽合金或碳纖維制造的）：從1975年垂直管轉頭向世後，近年來各主要離心機生產商開發的垂直管轉頭，單管容量0.2ml到4Oml，最高轉速從50,000rpm到120,000rpm,RCFmax可達
700,OOOXg，90年代開發的新機型和轉頭己能夠使質粒DNA垂直管離心分離實驗做起來得心應手。
使用垂直管轉頭分離純化質粒DNA的待點是：.
·由於沈降距離最短，離心時間最短，高效、低耗：
·離心管縱向剖面積遠大子橫向截面積，離心沈降時純祥品區帶的容量較大，在沒有沈澱附著或沈澱附著很緊很密的條件下分離純度高，樣品加載量也較大；流體靜壓力,不會因靜壓過高而使生物體顆粒受到損傷.離心管內樣品顆粒受到的流體靜壓為：
ω：角速度
r：樣品顆粒所在位置與旋轉中心距離（以厘米計）
r1:轉頭最小離心半徑即rmin（厘米），在使用gmax離心時是液面和旋轉中心的距離。
Pa:起始密度（對預形成梯度時為最小密度,對自形成梯度離心,為離心結束時最小密度）。
a：梯皮斜率
在超速離心中，P值相當大，壹般認為P≤150Okg/cm2,才不致損傷生物體顆粒，垂直管轉頭（r-r1）很小,相對說P也相當小（102數量級），而對甩平轉頭，在離心前往往要進行P值校核，過大時，應降低轉速。在用垂直管進行質粒DNA分離純化時，RNA沈澱附在離心管壁部，在減速、梯度方向轉換時,質粒DNA區帶從沈澱區"擦"過，使DNA中混入少量RNA而影響純度。
在極高轉速離心時（如大於80,OOOrpm），由於RNA附著壁部較緊,這種影響較小。
(2)近垂直管轉頭離心分離：為了消除垂直管轉頭用於質粒DNA離心在壁部形成的RNA沈澱對已形成的DNA區帶的汙染，同時也為了改進壹般斜角式轉頭（傾角25·~35·）由於沈降距離較長，因而分離時間也較長的缺點，近幾年開發了多種近垂直管轉頭（即Near VerticalTube Rot時,簡稱NVT轉頭或Neo Angle Rotor,小假角轉頭,簡稱NT).它們的離心管縱剖面中心軸線與離心機驅動軸線之間夾角在7.5·~10·之間,轉速從65,000rpm到120,OOOrpm，RCFmax可達646,000×g單管容量從2ml至13.5ml。NVT（或NT）轉頭的開發主要是為質粒DNA分離而設計，當然它也適用於線粒體DNA、染色體DNA、RNA及血清脂蛋白的分離·純化。
使用NVT（NT）轉頭分離純化質控DNA的特點是:
離心所需時間比垂直管轉頭稍長（增加30%~40%），但比壹般斜角式轉頭短（為同類斜角式轉頭分離時間的60%~70%）。
雖然因為傾角小而使RNA版離心管外壁下滑分力較小，但在加入表面活性劑(如0.1%~0.001%Trimn X-100）後，RNA沈澱可以較快地滑向離心管底部（即在自形成梯度時,RNA已到達底部），在梯度轉換過程中不影響質位DNA純度；
流體靜壓小，極高速運轉時也不會損傷生物體顆粒；
離心管縱剖面比壹般角式及甩平轉頭部大，分離純度高，樣品加入量較大。
（3）不連續階梯梯度分離:質校DNA分離純化傳統方法是采用金管CsCl自形成梯度平衡等密度離心法，離心開始時金管CsCl密度均壹，樣品均勻分布其中。
CsCl自形成梯度的離心時間可以用下式計算：
式中N：實際轉速(rpm)
P:樣品（如質粒DNA）在CsCl的浮動密度
r:從旋轉中心到純樣品帶中心的距離（厘米），作為初步結算，對質粒DNA離心，r位置可定在離心管中部，r平均刊點再偏外-10%。（rmax-rmin）。
F:取決於梯度材料及溶液初始密度的常系數〈表1〉。
S20.w：樣品（質粒DNA）在20℃水中沈降系數，可參照有關文獻決定。
[註]表中TCA為三氯乙酸,TFA為三氟乙酸
用以上公式算出的離心時間和實際離心結果非常接近。從公式可以看出T反比子（N4、r2），顯然在CsCi不結晶析出的前提下提高（N4、r2）將會減少離心時間,而增加轉速的效果特別明顯。但是對於某些較低轉速轉頭（如 65,000rpm以下）CsCl自形成梯度所需時間過長（10小時）以上，因此質粒DNA純樣品區帶形成的時間也比較長.
作為對全管初始等密度條件的改進，近幾年發展了階梯形不連續CsCl梯度的平衡等密度離心，即離心管初始梯度分二部分：
下部：高密度區（p=1.80-1.81g/cm3），占總容量1/3。
上部：低密度區（p=1.46-1.48g/cm），占總容量2/3，實驗證明，二階不連續CsCl梯度可比全管等密度離心所需時間要短得多（以12ml垂直管轉頭為例，質粒DNA，CsCl梯度55,000rPm，20℃；不連續二階梯度離心為5.5
小時,全管等密度離心為8小時）。
二階不連續梯度離心，樣品加在靠離心管底部的高密度區，無論對何種轉頭，其r很大；而且只存在樣品的上浮而不存在低密度區（低離心力口速度區）樣品的沈降；在接近DNA浮動
密度區初始密度差較大,自形成梯度，時間較短；由於以上原因縮短了離心時間。（4）超高速多級（轉速）分離：很明顯，根據T公式提高轉速將會加速CsCl梯度的形成，離心時間也會相應縮短。但是，在某溫度下的高轉速，長時間離心分離對於較高密度的CsCl來說很可能產生局部結晶析出，而局部結品析出不僅會影響梯度，而且會因析出的固態CsCl因損傷離心管壁而造成離心失敗或事故.為此,對於質粒DNA離心分離實驗，由於新型超速機的可編程序運轉的特點。可以從極高轉速逐漸向稍低轉速推移，每次實驗分成很多轉速擋，既提高了效率，又保證了實驗成功和安全。
當然，這類實驗是要經過多次摸索，才能形成常用的離心程序，美國Beckman公司和日本Hitact1i ko ki株式會社都在各自的先進的超速機上做了大量實驗，並向用戶推薦可靠、高效的離心理序[2、31。
三、典型的質粒DXA超速離心分離舉例
1.傳統分離舉例：
例（1）單管容量為12rnl，最高轉速在50,000rpm以下的角式轉頭，12PA密封管，各廠新型超速機。
樣品+TE液（配成pH8.0），EB加入量0.2mg/ural，加入CsCl配成全管p=1.57g/ml45,000rpm×36小時，20℃，慢減速或55,000rprn×16小時+40,000rpm×1小時，20oC慢減速-分離結果:管中部稍下形成純質粒DNA帶，中部稍上出現DNA片斷帶，近底部為RNA沈澱，上浮物為蛋白質。
特點：分離結果較好，但純樣品帶較寬，分離時間很長，用去近1億轉驅動部壽命。
例（2）單管容量為5ml，最高轉速為65,000rpm的鐵吊椅甩平轉頭，5PA管，樣品配置同例（1）
特點：同例（5） （用去0.2億轉驅動部壽命）。
36,000rpm×55小時,20℃,或32,000rpm×70小時,20·c。
·分離結果及特點：分離結果很理想，質粒DNA帶很窄，RNA沈降於離心管球底。但離心時間過長，成本較高（用去1.1億~1.3億轉驅動部壽命）。
2.垂直管轉頭離心分離：
例（3）日本日立cp100α主機，P100VT轉頭（700,000×g,8×5ml），5PA密封管，樣品及梯度配置同例(1)
100,000rpm×1小時50分,20℃,慢減速(7檔)。
·特點:離心結果與例(1)相似,由於轉速極高，壁部RNA沈澱很緊，在降速過程中對DNA汙染很少。離心時間很短，高效，低成本(用去0.12億轉驅動部壽命)。
例(4)最高轉速為50,000rpm的欽垂直管轉頭，容量8×40ml，40PA密封管，樣品配置如例〈1〉50,000rpm×24小時，20℃，慢減速。
特點：大容量分離，RNA沈澱對DNA帶稍有汙染。
3.近垂直管轉頭分離
例（5）Beclunar1NVT90轉頭XL-90主機，8×5時，5PA密封管，轉頭最高轉速90,OOOrpm，646,000×g。 樣品+TE液（配成pH8.0），E·B加入量為0.2mg/mh，TritmX-100加入量為0.01%，加入Cscl配成p=1.55g/ml。78,000rpm×4小時，20℃，慢減速。
特點：由於Triton X-100的作用，RNA沈澱加速滑向離心管底，轉頭減速過程中對DNA沒有汙染，分離結果很理想（用去0.2億轉驅動部壽命）。
例（6）日本日立CS12OEX或美Beckman
TLX微量超速機，最高轉速為120,OOOrpm的NVT（NT）轉頭，8×2時，2PA密封管，樣品及梯度液配置基本同例（5），但CsCL配成p=1.55z/ml,120,000rprnX3小時，20℃，慢減速。
4.不連續階梯梯度分離：
例（7）日本日立SRP83VT轉頭，80,000rprm，549,000g，8×5時，5PA密封管（日立CPα，β系列機或SC夏系列機），梯度液配置：
先配置TE液+Cscl，p=1.47g/時，***3.5ml，先註入5PA密封管。
再配置TE液+樣品+CsCl配成p=1.81g/mh E.B.0.2mg/ml，***1.5ml用註射器伸入管底緩緩註入使原先的p=1.47液上浮。
83,ooorpm×1小時，20℃，慢加速，慢減速，結果同例(3)。
特點：由於使用了二階不連續梯度,CsCl自形成梯度時間縮短。超高轉速，RNA沈澱很緊，對DNA帶汙染很小，高效，低成本（只用去0.05億轉驅動部壽命）。缺點是樣品加入量稍小。
例〈8〉日本日立RP55VF：轉頭，55,000rpm，293,000×g，12×5時，樣品及梯皮液配置同例（7） 55,000rpm×4.5小時，20·c，慢加、減速。結果與例〈7〉相似。
5.超高速多級（轉速）分離：
例（9）：BeckmanXL-90超速機，NVT-90轉頭90,000rpm，645,000xg，8×5ml，5.1PA密封管，樣品及梯度液配置同例（5）。
多級分離：90,000rpm×l.5小時+87,000rpm×0.25小時+83,000rpm×0.25小時+81,000rpm×0.50小時+80,000rpm×0.50小時，20℃，慢減速。（以上實驗亦可在日本目立CP100α或90α主機上做用PlOOVT轉頭，結果相同）。
特點：結果同例(5)，但時間降為3小時（0.16億轉）
例（10）Hitact1i微量超速CS-120EX或CS-10OEX微量超速機，SlOOAT5角式轉頭，100,OOOrpm，550,000×g，8×5ml，樣品及梯度液配置與例(3)基本同，但樣品+TE液配成p=1.55g/ER1。100,ooorpm×4.5小時+98,ooorpm×15分+96.ookpm×30分+94,ooorpm×30分+90,OOOrpm×25分+85.OOOrpmX30分（***7小時），20℃，慢減速。
特點：使用角式轉頭，微量超速機，在離心力較小的條件下（與大型超速機相比），離心時間較短，RNA沈向管底，分離結果很理想。
四、質粒DNA超速離心分離註意事項
1.防止汙染 防止脫氫酶汙染：脫氫酶能使DNA降解或變性，而它又無處不在（皮膚上，沒清洗並沒消毒的器具表面……），所以，在質粒DNA分離實驗的每壹個環節都要註意這壹點．有效的辦法是器具（離心管、蓋、註射器、移液器、盛器等等）的消毒（蒸氣消毒或0.1%焦破酸二乙商消毒）。雖然，我們可以加DFP（二異丙基確酸氟）或PMSF（苯用基確院氛）來抑制脫氫酶的降解使用,但主要手段還是清洗和消毒。為防止皮膚上核糖體汙染，操作時應戴上手術用手套。
2.防止重金屬鹽中存在的重金屬離子和DNA結合成復合物：CsCl為電離介質，在離心前CsCl應過柱以消除Cs離子，對接觸樣品的器皿也要清洗，並用去離子水沖洗。
3.樣品的加載量 祥品加入量與樣品濃度有關，為了提高分辨率，樣品加入量應加以控制，合適的加入量應以前人實驗作參考。自行試驗時，每毫升梯度液樣品量約為10μZ~20μg。
4.對於角式、垂直、近垂直轉頭的自形成梯度平衡等密度分離，可用。0~100Orpm快加速及1,000rprn~0慢減速，階梯梯度則要求慢加速，慢減速，近代起這機都提供了很好的範例，供用戶選擇加、減速速率時參考。
5.轉頭在離心開始時溫度應和離心運轉時工作溫度基本壹致（土5·C），轉頭預冷溫度過低（10oC以下）在極高轉速，短時間離心時，可能因來不及升溫而出現CsCl析出，使實驗失敗或發生事故。
6.合適的取樣方法：質粒DNA超速離心分離加樣較簡易，離心後取樣方法和操作水平將決定回收率和樣品純度。首先，取樣環境應和離心工作溫度相近（士5℃）；取樣時實驗臺上應無振動源；根據實驗室條件相應選擇橫向穿刺、底部空孔、離心管切割或用梯度儀收集。但無論哪壹種方法部必須小心行事。
7.合適的pH值，核酸類佯品在實驗全過程中都應保持在pH8.0的TE液中，pH值過高過低也會使DNA變性。
8.離心管及加液量：由於近代質位DNA的超速離心分離使用了非常高的轉速，對7可心管材質要求也很高，壹般做這類實驗的離心管只用壹次。最好是用密封管，而且壹段以選擇PA管為好。離心管存放朔不超過2~3年，使用密封管或有蓋薄壁管樣品要加滿。使用甩平轉頭液面EE管口2~3毫米以防止彎月面溢液或管口翻卷。