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Spatiotemporal analysis of human intestinal development at single-cell resolution
發表雜誌： Cell （IF：41.582）
發表時間： 2021年2月
應用技術： 10x Genomics單細胞測序、10x Genomics空間轉錄組測序等
腸道是人體最大的屏障器官，與腸道菌群***生，協調營養需求和免疫。多種相互關聯的細胞類型構成了成熟的腸道及其獨特的形態，但它們發育的分子基礎仍不清楚。本研究從不同發育時間點和組織位置的17個胚胎收集了77個腸道樣本，利用10x Genomics單細胞轉錄組測序及空間轉錄組測技術繪制了單細胞轉錄組數據的空間分布圖，展示了跨越時間、位置和細胞間隔的形態發生。另外，匯編了壹個整合的在線資源，包括細胞多樣性、細胞信號傳導和轉錄調控網絡，以突出祖細胞起源和位置命運決定。
1. 在發育時間和空間上對101種腸細胞類型進行分類
聚類分析分為9個腸腔，並根據轉錄標註註釋上皮、成纖維細胞、內皮（EC）、周細胞、神經（ENS）、肌層、間皮、肌成纖維細胞和免疫細胞，並發現具有明顯的位置和發育時間進程差異。根據關鍵的marker基因，進行精細的細胞註釋，***發現了101個細胞類型, 並繪制了所有101種細胞類型之間的相互作用圖，確定了兩兩細胞群體之間假定的受體-配體（RL）相互作用。
2. 單細胞的空間位置
對組織進行空間轉錄組（ST）分析，分析確定了每張切片中的5-13個斑點簇，它們映射到離散位置，使用單細胞圖譜作為參考，並確定每個斑點可能的單細胞轉錄組組成，從而在空間上定位所有單細胞亞群。鑒定了2,893個與深度相關的基因（<5％ FDR），反映了不同層次的活躍途徑——肌肉/神經過程（收縮/軸突形成）向吸收管腔功能（微絨毛組織和消化系統過程）發展的深度富集點，與細胞類型特征的順序富集相符。
3.?人 腸上皮發育
子宮上皮隱窩的形成建立了維持粘膜屏障的終生回路。單細胞測序捕獲了17,622個上皮細胞，這些上皮細胞通過marker基因分為吸收性、分泌性、未分化、以及幹細胞等，本研究觀察到近端（小腸[SI]）和遠端（結腸）樣本之間存在顯著的位置差異，這些差異由高特異性基因表達，並通過軌跡分析和幾個TF模塊證實，表明在隱窩形成之前，特定位置的轉錄程序已經在發育中建立起來。
4. 表皮幹細胞 的發展起源
研究人員觀察到近端和遠端表皮幹細胞隨著時間的推移逐漸增加，這與表皮幹細胞轉錄程序的早期位置差異形成對比，例如遠端LEFTY1?和近端FOXD1?及其下遊調控網絡基因。在早期發育中（孕後期12周前，PCW），研究人員發現了近端上皮幹樣祖細胞群，該細胞群發展為早期腸上皮細胞。這些細胞表現出許多原始功能，包括在中胚層分化重要的VTN?基因高表達，與表皮幹細胞相比LGR5?表達較少，並且ONECUT2?表達參與上皮發育。這些細胞在SI中特異表達TFGATA4?， SI是壹種小鼠早期內胚層調節因子，在12PCW後，其表達大部分丟失這些細胞高表達轉鐵蛋白（TF），證實了鐵代謝在絨毛形成中的重要性。
5. 特殊的神經上皮通路是表皮幹細胞發育的開始
分泌型譜系細胞在12 PCW時出現，在8-10 PCW時檢測到很少的杯狀細胞。然而，12 PCW後的杯狀細胞和腸內分泌細胞逐漸增加，反映出持續的成熟。分泌細胞進壹步細分為11個亞群，反映了不同的腸內分泌細胞亞型以及SI特異性Paneth細胞，杯狀細胞和NEUROG3?+?祖細胞群。腸內分泌細胞多樣性和相關網絡在很大程度上與隱窩形成壹起建立。
相比之下，BEST4/OTOP2?細胞在隱窩形成之前的最早時間點出現，轉錄水平已經不同，並且隨著時間的推移頻率沒有變化，這表明它們的發育可能與正常的隱窩-絨毛回路無關。此外，分析結果預測BEST4/OTOP2?與神經元細胞之間有很強的相互作用（同樣在發育早期建立）。
6. 腸道血管生成
轉錄標簽通常對應於結構特征，在內皮細胞中可以清楚地看到這壹點，將內皮細胞分為靜脈、動脈和淋巴管類型，並通過血管大小進壹步區分。在發育過程中，觀察到了從小血管到大血管的過渡，反映了腸道血管生成。相對於內皮細胞，周細胞亞型由血管生成驅動因子（PRRX1、THBS4?和ANGPT2）定義。進壹步研究表明在較早時間點的大多數細胞都是高度循環的祖細胞。
7. 腸神經系統和固有肌層
與7-8 PCW晚期發展出現的細胞類型相反，腸神經脊來源的細胞沿胃腸道遷移，進入包含神經元和膠質細胞的粘膜下和肌間神經叢。本研究確定了不同的神經元和神經膠質祖細胞，並捕獲了5個神經膠質細胞和7個神經元亞群。在成年腸道中，神經元叢被肌肉包圍，祖細胞和分化的腸平滑肌細胞（iSMCs）分別由PLPP2?和ACTA2?等基因標記。本研究確定了11個與iSMC相關的簇，包括PDGFRA?+間隙細胞和Cajal間隙細胞的早期種群。本研究確定了描述肌細胞的關鍵轉錄因子網絡，肌細胞中的KLF7?，間質細胞和OM細胞中的TWIST2?。FOXF2?在內肌中特別活躍，類似於在小鼠中的報道。
8. 發育中的腸固有層的間充質細胞
基於成人單細胞轉錄組測序中建立的命名法將成纖維細胞命名為成纖維細胞1-4 （S1-S4）亞型。根據時間、位置和周期的差異進壹步將它們細分為16個類。與成人相比，S3-like細胞不僅在子宮內形成了壹個主要的成纖維細胞群，而且表現出更大的異質性。軌跡分析表明，未成熟的S3樣細胞分裂為S3或S1/2/4譜系，另外發現S3-like祖細胞在增殖室中高度富集，表明這些細胞可能在這壹時期產生大量分化成纖維細胞。
在胎兒空間轉錄組切片中， 將壹些S3特異性基因的表達定位於成年組織中與脈管結構相鄰的spot上， 將胎兒細胞類型的標簽轉移到成人空間轉錄組切片上，結果顯示S3?HAND1+和S3?EBF+細胞的成年對應物聚集在大血管周圍，這突顯了這些細胞在形成腸血管支持方面的可能作用。
9. 引導腸道發育形態發生梯度的無偏映射
了解腸道發育的壹個基本問題是局部形態因子梯度及其拮抗劑如何形成腸絨毛形態發生。本研究創建了壹個涉及8條途徑的基因形態發生圖，用以闡明這些分子在空間和時間上的作用。利用***表達分析確定了11種細胞類型特異性和13種空間***定位的形態發生模塊。這些模塊通常與空間轉錄組中的組織深度壹致，空間模塊3由來自內皮細胞、成纖維細胞和周細胞起源的形態發生子組成，並且在組織深處。
10.? S2 成纖維細胞具有特定位置並控制上皮形成
隱窩周圍S2成纖維細胞或端粒細胞通過表達生長因子β（TGF-β）超家族配體和WNT通路來提供上皮支持。本研究在發育過程中發現了三個不同的S2亞群，這些S2特異性基因形成了壹個主要的粘膜下成纖維細胞形態發生模塊，該模塊包含DLL1，BMP5?和NRG1?。連同受體相互作用壹起，這突出了S2細胞及其在上皮形成中提供的豐富形態形成生態位的重要性。本研究證實S2標記F3在隱窩形成之前就已經存在，並且形成的突起隨著絨毛的形成而逐漸增加。因此，在人腸道中，S2型纖維母細胞不僅是維持上皮隱窩位所必需的，而且可能在其形成中發揮積極作用。
11 ．人類腸道免疫力的發展
a.? 淋巴組織形成過程中的免疫細胞異質性
本研究捕獲了發育過程中的2,199個免疫細胞，包括6個譜系（巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、適應性和先天淋巴細胞）。免疫細胞在SI中比結腸更為普遍，總體而言在孕早期之前尤其罕見。在10 PCW之前，觀察到了髓樣細胞富集，而在12 PCW時，湧入了大量的幼稚CD4+和CD8+?T細胞、NK細胞，1型先天性淋巴樣細胞（ILC），以及3型ILC。
b. S4 成纖維細胞是淋巴結構形成和維持的關鍵
派爾集合淋巴結（Peyer's patch）形成的其他關鍵介質包括基質組織細胞，它們通過CCL19、CCL21和CXCL13促進淋巴組織誘導細胞組織回歸。本研究發現它們特異性地定位於兩個S4成纖維細胞亞群，並且表達隨著發育而增加。S4細胞亞群中受體相互作用的繪制突出了與多種免疫細胞的交互作用，包括通過VCAM1-ITGB7?傳遞ILC3信號。這進壹步支持了S4在淋巴組織形成中的作用。
為了在空間上證實這些相互作用，本研究對成人空間轉錄組切片進行研究，其中粘膜下淋巴濾泡是獨特的結構。在這些濾泡內及周圍表達了S4和免疫細胞的關鍵標記基因，因子分析證實了多種成人免疫細胞（B細胞、T細胞和髓系細胞）和S4細胞類型。本研究還發現空間轉錄組中關鍵受體對的顯著***定位，表明S4細胞是成年結腸中與卵泡相鄰的成纖維細胞，在胎兒腸道淋巴組織發育過程中以時間依賴性方式出現。綜上所述，這表明派爾集合淋巴結中相同的隱窩周圍成纖維細胞作為上皮隱窩生態位支持細胞、淋巴組織形成的協調者和基質-免疫交互的介質，從而揭示了它們迄今為止未被認識到的高度動態的作用。
12. 繪制先天性腸道疾病的細胞基礎
為了揭示可能導致先天性腸道疾病的時間關鍵性轉錄缺陷，本研究通過將749個已知的疾病基因與本研究中的單細胞轉錄組數據整合在壹起，進而將先天性疾病與可能通過高度細胞類型特異性缺陷表現出來的表型，以及導致腸道、腹側、會陰、神經節、炎癥或腫瘤病理疾病的表型聯系起來。
本研究將單細胞轉錄組測序和空間轉錄組測序進行聯合，繪制了隨時間變化的腸道形態發生。確定了101個細胞狀態，包括上皮細胞和間充質祖細胞群以及與關鍵形態發生相關的重要階段過程。描述了隱窩-絨毛軸形成的原理，神經、血管、間充質形態發生和腸道的免疫種群，鑒定了發育中的成纖維細胞和肌纖維細胞亞型的分化層次，並闡述了它們的不同功能。明確了佩爾斑和腸道相關淋巴組織的起源，並描述了位置特異性免疫程序。本研究使用這壹資源來呈現了形態發生梯度的無偏分析，這壹梯度能夠指導細胞分化的連續波並定義與罕見發育性腸道疾病相關的細胞和位置，匯編了壹個公開可用的在線資源，即胎兒腸道發育的時空分析資源（STAR-FINDer），以期促進後續的相關研究工作。
參考文獻
Fawkner-Corbett D,Antanaviciute A, Parikh K, et al. Spatiotemporal analysis of human intestinaldevelopment at single-cell resolution. Cell , 2021, 184: 1–17.
劉靜 | 文案