在1941年日軍進攻香港時，港九大隊從200人擴展到超過6000人。在英軍撤退後，港九大隊隊員獲取被英軍丟棄的武器，並在新界及九龍建立基地，同時在西貢墟建立地下聯絡系統。而第三個和第五個分支在蔡國梁之下，被派遣到香港和九龍，由隊長黃冠芳和副隊長劉黑仔帶領，統領香港及九龍的抗日武裝鬥爭，並讓中國獲取日本對華南、臺灣和東南亞的戰略機密。
港九大隊屬下有短槍隊和幾個區中隊，隊員竭力攻擊強盜和日軍，保障農作物及人命安全。港九大隊亦幫助破壞日本在香港的軍事據點，和促進了在中國人、英國人和美國人之間友誼。在使用遊擊戰的常規戰術下，他們殺死了壹些漢奸和其同黨，在九龍和廣州保護貿易商人，攻擊大埔的警察局，並轟炸啟德機場。 香港淪陷時，有壹大批中國文化界知名人士和愛國民主人士，以及國際友人滯留港島，處境十分危險。港九大隊克服重重困難，配合廣東人民抗日遊擊隊先後從香港營救出何香凝、柳亞子、茅盾、鄒韜奮等700多人，壹些國民黨官員和眷屬、遇險的美國航空隊飛行員以及港英官兵和荷蘭、比利時、印度等國的人士近百人，在國內外影響很大，對促進抗日民族統壹戰線和國際反法西斯統壹戰線的工作，起到了積極的作用。
港九大隊在營救英國和其他外國人士上亦扮演了重要角色，***有20名英國人、54名印度人、8名美國人、3名丹麥人、2名挪威人、1名蘇聯人，以及1名菲律賓人獲拯救，包括被囚的賴特上校等英軍官兵及美軍飛行員，此外亦有大批內地教育界、新聞界、文化界人士獲救。
另外，港九大隊亦協助營救戰俘，包括著名的賴廉士爵士、祈德尊爵士、王國棟教授和David Bosanquet。
港九大隊對盟軍最重大的貢獻，是搶救了8名因日軍擊落其飛機而跳傘到九龍的美國飛行員。當時為1944年2月11日，美軍第十四航空飛行指揮員兼教官克爾(Donald W. Kern)中尉在轟炸啟德機場時被日軍擊中，跳傘降落觀音山，後得到遊擊隊小交通員李石仔等救助才能逃出日軍的搜捕。 1942年4月，港九大隊隊員加強了對大嶼山的控制，強化與澳門和廣州的通信。1943年12月2日，“廣東人民抗日遊擊隊”改編為“廣東人民抗日遊擊隊東江縱隊”，簡稱為“東江縱隊”，而港九大隊仍是它下轄的壹個分隊。