1、在外觀上，機身正面，除了型號名稱差異外，尼康D300S比D300多了3個麥克風的小孔。機身背面，由於尼康D300S具有視頻拍攝功能，顯示屏右邊的按鍵排列作了調整。
2、在接口上，尼康D300S使用的是更為主流的MINI HDMI接口，同時由於視頻功能的增加，支持外接立體聲麥克風，所以也新添了外置麥克風的接口。其他的接口與D300相同。
3、在儲存上，尼康D300S增加了SD存儲卡，並且可以SD卡與CF卡雙卡使用，有三種工作模式可選，適應不同的需求。
4、在功能上，尼康D300S增加可拍攝720p的高清視頻，並支持3種視頻尺寸，另外新增麥克風靈敏度的設置，對於外接立體聲麥克風來說，實用度更高。
尼康D300S增加了虛擬水平儀的功能，開啟以後，可以在界面中看到相機是否處於水平狀態，傾斜的角度也可以直觀地顯現。
參考資料：
中關村在線-尼康D300和尼康D300S區別