完整的實驗離不開後續的驗證。 話不多說，接下來我們就細數壹下 MeRIP-seq ，都有哪些相關的 驗證實驗 吧~
首先，如果需要對m6A修飾位點進行嚴格的驗證，可以用下面這個方法：
m6A-IP-qPCR ，也叫MeRIP-qPCR，即 m6A抗體富集到帶甲基化修飾的RNA，下壹步使用qPCR直接對富集到的RNA進行定量 的壹種技術。
m6A修飾的過程，離不開 甲基轉移酶（writer）、去甲基轉移酶（eraser）和閱讀蛋白（reader） 的作用。如下圖，展示了與m6A修飾作用相關的 各種RNA結合蛋白 ：
所以， RNA-蛋白質 、 蛋白-蛋白互作 ，也是MeRIP-seq後續實驗驗證關註點，那麽讓我們看看驗證RNA與蛋白以及蛋白質之間相互作用的實驗有哪些吧~
主要是用來研究體內 RNA與蛋白結合 情況。比如，檢測 reader蛋白與RNA 的具體結合情況。
該方法具體是利用 針對目標蛋白的抗體 把相應的 RNA-蛋白復合物沈澱 下來，通過 分離純化 ，對結合在復合物上的RNA 進行 RT-PCR驗證或測序分析 ，了解轉錄後調控網絡動態過程。
（METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma. Molecular cancer, 2019）
研究 RNA與蛋白質互作 的壹種技術。利用 生物素標記的RNA探針 ，通過與含有目的蛋白的溶液孵育，形成 RNA-蛋白質復合物 。復合物可以特異性結合磁珠，從而與孵育液中的其他蛋白分離。復合物洗脫後，通過 蛋白凝膠電泳實驗 ，檢測特定的RNA與蛋白的結合情況。
（METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma. Molecular cancer, 2019）
體外檢測蛋白質與蛋白質之間相互作用，用於驗證 兩個已知蛋白的相互作用 ，或者 篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白 。
該實驗基於 GST（glutathione-S-transferase），即谷胱甘肽-S-轉移酶蛋白 ，可以與谷胱甘肽（Glutathione，GSH）結合。
將GSH固定於瓊脂糖珠上，形成GSH-瓊脂糖珠，將已知蛋白X與GST融合表達，獲得的GST-X可與GSH-瓊脂糖珠結合，若環境中存在與X蛋白互做的蛋白Y，則會形成 “瓊脂糖珠-GSH-GST-X-Y”復合物 ，與X蛋白互做的蛋白即可被分離並檢測。
（Sec62 promotes stemness and chemoresistance of human colorectal cancer through activating Wnt/β-catenin pathway. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research . 2021）
當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多 蛋白質-蛋白質間的相互作用 被保留了下來。
如果用蛋白質A（圖中紅色方塊）的抗體免疫沈澱A，那麽與A在體內結合的蛋白質B（圖中黑色方塊）也能沈澱下來。 若B為已知蛋白，用WB驗證A和B互作；若B為未知蛋白，用質譜可知與A互作的蛋白。
（METTL14 regulates M6A methylation-modified primary miR-19a to promote cardiovascular endothelial cell proliferation and invasion. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2020）
已知m6A修飾會影響 RNA的翻譯效率 。 Ribosome profiling sequencing（Ribo-seq)） ，是針對核糖體結合的RNA進行測序。
該方法富集 與核糖體結合的正在翻譯的RNA ，然後通過測序對富集的RNA進行定量，從而實現 對翻譯強度進行定量 。
（1、N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 2015 Jun；
2、Ribosome Profiling: Global Views of Translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2018 July ）
檢測RNA半衰期的方法有很多。比如，可以 利用轉錄抑制劑放線菌素D抑制細胞內基因轉錄後 ，在不同時間點收集總RNA，然後做 Northern或者RT-PCR ，比較不同時間點mRNA豐度的變化。如下圖，Boxuan Simen Zhao.在“Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications”壹文中通過半衰期講述m6A修飾對mRNA穩定性的影響。
除了壹系列的分子生物學上的驗證，當然也少不了細胞水平和動物模型方面的實驗，接下來也順便簡單了解壹下吧![圖片]
通常實驗過程中，要證明某基因在細胞中行使什麽樣的功能，可以利用 質粒及慢病毒等載體 ，在細胞中對該基因進行 敲低（knockdown）、敲除（knockout） 或過 表達（overexpression） ，然後再通過 RNA-seq、免疫熒光、細胞表型（遷移、侵襲、增殖、雕亡、周期）實驗 等，說明該基因在細胞內環境中行使的功能。
（1. Zhao W et al. METTL3 Facilitates Oral Squamous Cell Carcinoma Tumorigenesis by Enhancing c-Myc Stability via YTHDF1-Mediated m6A Modification. Mol Ther Nucleic Acids. 2020；
2. N6-Methyladenosine METTL3 Modulates the Proliferation and Apoptosis of Lens Epithelial Cells in Diabetic Cataract. Mol Ther Nucleic Acids. 2020）
是指各種醫學科學研究中建立的具有人類疾病模擬表現的動物，可分為自發性動物模型和誘發性動物模型。
動物疾病模型，主要用於實驗生理學、實驗病理學和實驗治療學（包括新藥篩選）研究，涵蓋動物 病理解剖、HE染色、免疫組織化學檢測 等。
（1. RNA N6-methyladenosine methyltransferase-like 3 promotes liver cancer progression through YTHDF2-dependent posttranional silencing of SOCS2.Hepatology. 2018 Jun；
2. Anti-tumour immunity controlled through mRNA m6A methylation and YTHDF1 in dendritic cells. Nature. 2019 Feb）