構建1.1 cDNA文庫的基本原理和方法
cDNA文庫是指將生物某壹發育時期轉錄的全部mRNA逆轉錄形成的CDNA片段與某壹載體連接而形成的克隆的集合。構建經典cDNA文庫的基本原理是使用Oligo(dT)作為逆轉錄引物，或者使用隨機引物在合成的cDNA上添加合適的接頭，連接到合適的載體上，獲得文庫。其基本步驟包括:RNA提取(如異硫氰酸胍法、鹽酸胍-有機溶劑法、熱酚法等。，而提取方法的選擇主要取決於不同的樣本)。構建高質量的cDNA文庫，獲得高質量的mRNA是非常重要的，所以在處理mRNA樣本時壹定要小心。由於RNase存在於所有生物中，能夠抵抗煮沸等物理環境，因此建立壹個無RNase的環境對於制備高質量的RNA非常重要。獲得高質量mRNA後，在逆轉錄酶Oligo(dT)的指導下合成cDNA第1號鏈，合成cDNA第2號鏈(使用RNase H和大腸桿菌DNA聚合酶I，包括使用T4噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌DNA連接酶的修復反應)。加入合成接頭，將雙鏈DNA克隆到載體中，分析cDNA插入片段，擴增cDNA文庫，並鑒定所建立的cDNA文庫。這裏強調的是矢量的選擇。常用λ噬菌體，因為λ DNA兩端有12個核苷酸的粘性末端，可用於構建余弦質粒，可容納外源DNA的大片段。
1.2 cDNA全長文庫
經典cDNA文庫的構建雖然高效簡單，但文庫克隆的片段普遍較小，單個克隆上的DNA片段太短，能提供的遺傳信息很少。它們中的大多數需要幾個克隆來覆蓋整個基因的完整cDNA。為了克隆真正的全長cDNA，建立全長cDNA文庫具有重要意義。因此，需要克服僅由mRNA合成PolyA tail所帶來的局限性和普通逆轉錄酶的特性。全長cDNA文庫是指通過逆轉錄從生物體內的壹套完整的mRNA分子中獲得的DNA分子群，是該mRNA分子群的完整拷貝。全長cDNA文庫不僅可以提供完整的mRNA信息，還可以通過基因序列比對獲得mRNA剪接信息。此外，它還可以預測蛋白質序列並在體外表達，並通過反向遺傳學研究基因的功能。目前報道的全長文庫的構建壹般是按照美國CLONTECH公司的Smart cDNA文庫構建試劑盒方法或通用試劑盒使用說明(美國Invitrogen)進行的。判斷cDNA文庫中的cDNA序列是否為全長基因cDNA主要有幾種方法。
1.2.1直接從序列中求值。
5’端:如果有同源全長基因的比較，可以通過與其他生物已知的相應基因的5’端進行比較來判斷。如果沒有同源基因的新基因，首先判斷編碼框是否完整，即開放閱讀框中第1位ATG上遊的同壹框中是否有終止密碼子；其次，判斷是否有轉錄起點，壹般在5’帽結構後有壹個嘧啶富集區，或者cDNA的5’序列與酶切保護的基因組序列部分相同，那麽就可以確定得到的cDNA的5’端是完整的。3’端:也可以通過比較其他生物已知的相應基因的3’端來判斷，或者編碼框下遊有終止密碼子，或者有1以上的PolyA加尾信號，或者有PolyA尾但沒有明顯的加尾信號。
實驗證明1.2.2。
5’端和3’端的長度可以通過引物延伸法確定，如5’端RACE和3’端RACE，或者大小是否壹致可以通過Northern Blot確認。
用1.3分析cDNA文庫
評價cDNA文庫的質量主要有兩個方面。第壹個方面是圖書館的代表性。cDNA文庫的代表性是指文庫中包含的重組cDNA分子反映了源細胞中表達信息(即mRNA類型)的完整性，這是文庫質量最重要的指標。文庫的代表性可以通過文庫容量來衡量，文庫容量是指原始cDNA文庫中包含的獨立重組克隆的數量。文庫的容量取決於源細胞中表達的mRNA的類型和每個mRNA序列的拷貝數。65，438+0正常細胞含有65，438+00，000 ~ 30，000種不同的mRNA，按豐度可分為低豐度、中豐度和高豐度三種，其中低豐度mRNA是指當某壹種mRNA占細胞總數組的比例小於0.5%時。滿足最低要求的cDNA文庫的文庫容量可由Clack-Carbor公式N = ln(1-P)/(1-1/N)計算得出(P為文庫中任何mRNA序列信息的概率，通常設為99%；n是文庫中具有P概率的細胞中任何mRNA序列的重組克隆的理論最小數目；n是細胞中最稀有的mRNA序列的拷貝數；t是細胞中表達的所有mRNA的總拷貝數)。第二個方面是重組cDNA片段的序列完整性。細胞中表達的各種mRNA片段的序列完整性。各種mRNA在細胞中表達的具體序列雖然不同，但基本都由三部分組成，即非翻譯5’區、中間編碼區和非翻譯3’區。非翻譯區的序列特征在調控基因表達中起著重要作用，編碼序列是合成的基因產物——蛋白質模板。因此，為了從文庫中分離並獲得目的基因的完整序列和功能信息，要求文庫中的重組cDNA片段足夠長，以盡可能反映天然基因的結構。
2其他類型的cDNA文庫構建
2.1同源cDNA文庫
是指特定組織或細胞的所有表達基因都包含在其中，cDNA文庫中與表達基因對應的cDNA拷貝數相等或接近。WEISSMAN很早就提出了cDNA文庫可以通過基因組DNA的飽和雜交原理進行均質化的理論。但這壹理論壹直被認為無法應用於實踐。主要限制因素是難以為飽和雜交提供足夠的表達豐度極低的cDNA，可能造成部分基因的cDNA丟失。20年前，基於DNA-RNA雜交的研究已經將基因的轉錄水平分為高、中、低三類。後續研究進壹步表明，大多數基因處於中或低表達豐度，在單個細胞中含有近1 ~ 15拷貝，而高豐度基因的轉錄產物在單個細胞中可達5000拷貝左右，約占總表達量的25%。這種基因表達能力的巨大差異成為獲得完整的、有代表性的cDNA文庫的障礙，其表達量的巨大差異為大規模研究增加了困難。對於單個組織cDNA文庫，大量高拷貝基因序列的存在給基因篩選和鑒定帶來不必要的浪費，尤其是在大規模EST測序中。
同源化cDNA文庫是克服基因轉錄水平的巨大差異給文庫篩選和分析帶來的障礙的有效措施，有利於基因表達和序列分析的研究。目前同源cDNA文庫的構建至少有兩種主要觀點:壹種是基於復性動力學原理，退火條件下高豐度cDNA的復性速度快，而低豐度cDNA的復性時間長，因此可以控制復性時間來降低豐度；另壹種是基於基因組DNA在拷貝數上的相對同質性，通過c DNA與基因組DNA的飽和雜交，降低文庫中高拷貝cDNA的豐度。第壹種方法的掌握需要很高的技術，壹般人需要多次摸索才能找到最佳條件；後壹種方法容易掌握，但也有研究者根據復性動力學原理提出其缺點，即基因組DNA飽和雜交的方法，由於低拷貝表達基因拷貝數少，不會雜交。目前報道的同源cDNA文庫大多是根據第二原理構建的，常用的策略是基於PCR技術的mRNA-cDNA雜交結合cDNA多次復性。有報道稱，對篩選出的高表達靶序列進行分析後，均質化處理後文庫的高豐度表達cDNA為處理前的0.3% ~ 2.5%，基本滿足節約篩選的要求。
同質cDNA文庫有以下四個優點:壹是在經濟上有廣泛的應用空間，可以節省大量的實驗成本。其次，增加了克隆低豐度mRNA的機會，適用於各種發育階段或組織的基因表達分析和突變檢測。第三，mRNA拷貝原始豐度對應的cDNA探針與均質化的cDNA文庫雜交，可以估計大部分基因的表達水平，發現壹些組織特異性基因。但是，以前的文庫構建忽略了mRNA豐度的影響。第四，可以用來制作基因圖譜，進行大規模的原位雜交。作為壹個優化的文庫系統，它還可以用於大規模測序或芯片制作。
2.2消減cDNA文庫
消減文庫又稱消減文庫，是利用兩種遺傳背景相同或幾乎相同但功能或特性不同的材料(如不同基因處理的細胞系或植物的近等基因系)提取mRNA(或反轉錄後合成cDNA)。在壹定條件下，將大量過量的無目的基因的壹方作為驅動物，與帶有目的基因的測試物雜交，選擇性地去除同壹基因的兩部分雜交形成的復合物，雜交-去除過程往往要進行多次。最後，收集含有相關靶基因的未雜交部分，並連接到載體上形成文庫。消減雜交是構建消減cDNA文庫的核心，消減文庫構建的成功很大程度上取決於消減雜交的效率。消減雜交的主要方法有(1)羥基磷灰石柱層析(HAP)；(2)生物素標記和鏈親和蛋白結合排除法；(3)結合限制性內切酶技術的消減法；(4)消減抑制雜交(SSH)；(5)磁珠介導的MAST，其中SSH法最常用。
抑制性消減雜交(suppression Subtractive Hybridization，SSH)是DIATCHENKO等人在1996中發展起來的壹種分離差異表達基因的新方法，主要用於分離兩種細胞或兩種組織的細胞中差異表達的基因。它主要是利用抑制性PCR對消減雜交後豐度相同的靶材料中兩端連接子不同的差異表達片段進行指數擴增，而兩端連接子相同的同源雙鏈片段只進行線性擴增，從而達到富集差異表達基因的目的。因此，應用該技術可以有效、快速、簡便地克隆兩種差異表達材料(細胞或組織)的高、中、低豐度目的基因。近年來，已成功應用於植物發育、腫瘤和疾病以及外界因素誘導的組織和細胞中相關反應基因的分析和克隆。
2.3固相cDNA文庫的構建
固相合成cDNA是壹項長期以來眾所周知的技術，但其局限性在於oligo(dT)與纖維素膠體顆粒或磁珠結合牢固，洗脫cDNA時產率不是很高，且後續反應步驟無法在介質中進行，這可能是該技術未被廣泛應用的原因。
最近THOMAS ROEDE提出了壹種固相合成cDNA文庫的新方法(THOMAS ROEDE，1998)，克服了以往文庫構建中的不足。所用的酶和試劑與傳統方法完全相同，只是cDNA的合成和修飾是在固體載體-磁珠上完成的。CDNA通過壹個生物素固定在鏈黴素偶聯的磁珠上，這樣在反應過程中酶和緩沖液可以方便快捷的更換，所以會很快與高質量的文庫構建結合起來(構建壹個文庫只需要1 d)，構建的文庫適用於大多數研究目的。
固相cDNA合成法的主要優點是可以簡化cDNA合成的操作。更換緩沖液時，不用擔心cDNA的丟失或其他物質的汙染。此外，由於在克隆前省略了分級和分離的步驟，通過這種方法可以獲得真正的代表性文庫，該文庫包含短cDNA。總之，固相法結合了傳統cDNA合成的優點，彌補了其缺點。該方法簡單、可靠、廉價，文庫質量高，有可能取代目前使用的cDNA文庫操作方法。
此外，最近開發的micro-RNA的cDNA構建利用PCR技術在實驗室條件下擴增mRNA的cDNA量，PCR檢測的靈敏度遠大於RT-PCR。微量RNA cDNA PCR文庫的構建可以為微量活性物質遺傳基因的研究提供便利。
利用3 cDNA文庫分離新基因的方法
發現、分離和克隆新基因壹直是分子生物學研究的主要任務和目的。雖然cDNA文庫有很多用途，但它最重要的用途是分離新基因。無論是上面提到的哪種cDNA文庫，都可以用來分離新的基因，只是使用的方法不同。有兩種主要的分離方法:第壹，對於非全長cDNA文庫，無論是經典的cDNA文庫方法還是通過差減法構建的cDNA文庫，都需要利用獲得的新cDNA序列片段獲得新基因的全長序列。其次，全長cDNA文庫和目的基因片段被用作雜交篩選的探針。
3.1從非全長cDNA文庫中篩選新基因
3.1.1比賽方法
RACE文庫是cDNA末端的快速擴增(RACE)，只需知道mRNA中的壹個短序列，就可以擴增其cDNA的5’(5’RACE)和3’(3’RACE)。該方法的主要特征是使用根據已知序列設計的特異性引物和與mRNA的PolyA(3’RACE)或添加到第壹鏈cDNA的3’末端的同源尾(5’RACE)互補的通用引物。因為同源引物不是好的PCR引物，並且為了便於RACE產物的克隆，可以在同源引物的5’末端添加壹個核酸內切酶位點。所用的cDNA模板可以通過使用聚dT引物(3’，5’-RACE是可接受的)延伸來合成。當RACE PCR的產物是復雜的混合物時，壹些產物可以用作模板，位於原始引物內部的另壹個序列可以用作引物，與通用引物配對，進行另壹輪PCR(巢式PCR)。早在1988年，FROHMAN等人就用這種方法成功獲得了四種mRNA的5’和3’末端序列。
到目前為止，已經有幾種改進的RACE方法，通過修改和優化，與最初的FROHMAN報道有所不同:(1) BARSON等人利用鎖定的寡脫氧胸腺嘧啶核苷酸引物“鎖定”了基因特異序列的3’端及其Poly (A)尾，合成了1 cDNA鏈。消除了在合成第1位cDNA鏈時oligo (dT) RNA模板的Poly (A)尾的任何部分結合所造成的影響。(2) EDWARDS和TROUTT團隊利用T4 RNA連接酶將寡核苷酸連接到單鏈cDNA的5’端，然後利用3’端特異性引物和錨定引物在體外直接擴增和克隆錨定的cDNA。隨後，伯特林等人用DNA連接酶代替RNA連接酶。這些方法都避免了由於第二條cDNA鏈中同源序列區域的互補而產生截短的cDNA。(Maruyama等提出的cRACE法使用基因特異性引物，因此基本不產生非特異性PCR產物。Clontech等公司也根據RACE方法的更新推出了RACE的相應試劑盒，為克隆cDNA提供了方便的工具。最近，黃等用RACE試劑盒克隆了含有植物血凝素的免疫受體。
3.1.2通過PCR從cDNA文庫中快速克隆基因
通過篩選文庫或應用簡並引物進行PCR反應，往往只能獲得不完全的cDNA片段。為了獲得全長cDNA，經常需要重新篩選文庫。重新篩選圖書館需要很多工作。雖然RACE為此提供了便利，但需要重新提取mRNA和逆轉錄。而PCR從cDNA文庫中快速克隆基因的方法，只需要提取λ噬菌體DNA，根據保守序列設計PCR引物，就可以克隆未知片段。特別是當基因兩端差異較大，中間某個區域保守時，很容易通過PCR獲得全長cDNA。同壹轉錄產物有不同的剪接模式，通過篩選文庫同時篩選出不同剪接模式的克隆的可能性較小，但有利於PCR擴增後觀察不同的剪接模式。此外，為了研究基因在不同組織中的表達，常采用差異顯示法尋找特定的mRNA。
3.2從全長cDNA文庫進行雜交篩選
3.2.1標記探針cDNA文庫篩選方法
CDNA文庫通常塗在主培養基上，然後將這些菌落的樣品印跡在硝酸纖維素膜或尼龍膜上；此時，加入標記的探針，如果出現雜交信號，可以從母盤上分離並培養含有雜交信號的菌落。對陽性克隆進行篩選和測序以獲得全長cDNA。該方法可避免PCR擴增的非特異性擴增或錯配，是壹種更準確可靠的cDNA克隆方法。主要缺點是克隆過程需要壹系列的酶促反應，產率低，耗時，工作量大。該方法適用於高表達基因的篩選和分離。用作標記探針的DNA片段可以是其他生物的基因片段，在這種情況下，篩選的基因往往是分離基因的同源基因；如果用作標記探針的DNA片段是新分離的蛋白質氨基酸反分析設計的DNA序列，或者是特定的分子標記DNA序列，那麽就可以篩選出新的功能基因。
3.2.2反PCR
反式PCR克隆全長cDNA的基因原理是:雙鏈cDNA合成後，首尾相連，環化的cDNA被位於已知序列的限制性內切酶酶切位點切割或用NaOH處理變性，然後用兩條基因特異性引物擴增線性化或變性的cDNA。反式PCR的優點是使用兩個基因特異性引物，不容易產生非特異性擴增。該方法可以快速高效地擴增cDNA或基因組中已知序列兩側的片段。
4摘要
隨著生物學和信息技術的飛速發展，尋找新基因、克隆新基因，進而研究基因的功能已經成為功能基因組學研究的重要任務。在過去，差減雜交、mRNA差異顯示、cDNA的代表性差異顯示分析和差減顯示是發現新基因的最廣泛使用的方法。這些方法在新基因的發現上有自己獨特的優勢，可以發現壹些差異表達序列，但這些差異表達序列大多是不完整的基因。目前最可行、應用最廣泛的方法主要是cDNA文庫的篩選。壹方面，cDNA文庫只代表壹定時期、壹定條件下正在表達的基因，而且是整個真核基因組中的少數序列，所以cDNA克隆的復雜度比直接從基因組中克隆要小得多；另壹方面，由於每個cDNA克隆只代表壹個mRNA序列，基因克隆過程中的假陽性概率相對較低，因此cDNA文庫的構建成為當前分子生物學研究和基因工程操作的基礎。本文涉及的cDNA文庫構建方法是目前常用的方法。這些方法各有利弊。研究人員應該根據自己的實際情況選擇合適的技術，這些技術已經達到了預期的目標。