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光呼吸的特點

生物催化劑—酶具有幾個特點,其中之壹是專壹性,就是說酶通常只催化壹種反應物作壹種反應。人們稱之為“底物專壹性”和“反應專壹性”。但光呼吸之所以能發生,是因為Rubisco的“兩面性”,即對RuBP除羧化作用(為RuBP添加-COO-基團)進行光合作用外,還具有加氧酶功能(為RuBP添加兩個氧原子),並將RuBP導入光呼吸進程。該酶的活性中心不能分辨氧氣和二氧化碳。兩種氣體***同爭奪Rubisco的活性中心,在酶動力學上該現象被稱為“競爭性抑制”,這在酶這種高效催化劑之中是很少見的。雖然在空氣中二氧化碳/氧氣比為0.035%/21%,而且在葉片的氣腔二氧化碳的濃度比外界氣體更低。但是在25°C水中,二氧化碳的溶解濃度為11µM,而氧氣的為253µM,兩者之比為1/23。考慮到Rubisco對二氧化碳的80倍於氧氣的高親和力(見表中CO2/O2專壹性),羧化作用:加氧作用稍低於80:23,約4:1到2:1,碳固定仍處於盈余狀態。 決定Rubisco反應平衡的因素

氧分壓和二氧化碳分壓之比例是外界決定Rubisco反應平衡的因素之壹。當氧分壓增大而二氧化碳分壓下降時,Rubisco的加氧酶活性上升,氧氣進入C2循環。

另外,空氣溫度和濕度,光照強度也是影響碳固定速率的因素。

現今在植物細胞葉綠體基質中的Rubisco,其實早在35億年前已在第壹批化學無機營養生物內出現。當時地球原始大氣中缺乏氧氣而二氧化碳濃度相對較高,酶的加氧特性被壓抑而羧化作用明顯。強羧化作用對植物生長有好處。後來到了15億年前大氣中氧濃度增高,光呼吸才慢慢增強。此時Rubisco已無法區分氧氣和二氧化碳了。 光呼吸消耗非常多的能量和還原當量。而且還會降低二氧化碳的固定效率。但是1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的結構十分復雜,通過緩慢的隨機變異去改變活性中心,要做到既能保留光合作用的功能,又要消除光呼吸,這顯得不太可能。即使是人類有目的的實驗也未能做到。科學家壹直就努力通過細胞生物學技術重組1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活性中心的氨基酸序列,但改善不大。看來要徹底解決光呼吸,涉及到該酶活性中心氨基酸序列的大規模更換和編碼基因的重編程(Reprogramme),而這是技術難以實現的。

藍藻和高等植物Rubisco的羧化和加氧活性比在25°C的空氣中為4:1到2:1。這就已經意味著巨大的損耗,五分壹到三分壹RuBP將會被副反應利用而暫時不能用到卡爾文循環中,而且其回滾過程也意味著能量和底物的損耗。如果因為氧濃度升高或空氣溫度增加,比率降低到1:2的話,光合作用中的碳固定效果被完全抵消,碳代謝被平衡,植物將會停止生長。但是在大部分的環境下,自然選擇的壓力還不至於如此苛刻,每每要光呼吸耗盡所有光合作用之所得,而且壹定要植物發展出壹套適應策略去降低光呼吸才能生存。所以說,大部分植物還是可以“奢侈”地承受光呼吸的。而那壹小部分不能承受光呼吸損耗的植物,則是那些生活在熱帶高溫地區,或是生存密度高,競爭大地區的植物。這裏自然選擇要求這些植物發展出壹套獨特的機制去壓制光呼吸。

C4植物的光呼吸壓制策略

而生活在幹旱地區的C4類植物卻能很好的抑制光呼吸,因此它們比C3類植物更經濟。這套機制並不涉及Rubisco的改造。C4植物的葉面有著“花環解剖結構”(德語:Kranzanatomie),植物的物質傳導管道,即維管束,被壹圈特化的細胞—維管束鞘細胞所包繞,維管束鞘再外面則是葉肉細胞。之所以說是“特化”,是因為維管束鞘細胞的結構與C3植物的不同,維管束鞘細胞和葉肉細胞存在分工現象。

首先是維管束鞘細胞的葉綠體,有些C4植物的維管束鞘細胞含有基粒退化的葉綠體,被稱為無基粒葉綠體,這些葉綠體只含間質片層。而在光合作用的光反應中所需的光系統II(Photosystem II)主要是分布在基粒上。基粒的缺失意味著光反應不能正常進行。因此,無基粒葉綠體變成了專師暗反應的場所。

還有,葉肉細胞與外界可以進行氣體交換,而且與C3類植物不壹樣,C4類植物的葉肉細胞不再被區分為海綿和柵欄葉肉組織,這樣,維管束鞘細胞的與外界氣體進行交換就被葉肉細胞取代了。雖然葉肉細胞和維管束鞘細胞被它們自身的木栓質細胞壁所隔開。但是兩者之間具有廣泛的胞間連絲聯系,這種聯系使得兩者之間新陳代謝產物進出成為可能。如果破壞這種結構,反而會降低組織間物質流動速度,造成CO2在維管束鞘漏逸,降低相關酶的活性。可見,葉肉細胞則成了碳固定的場所。

綜上兩點,C4植物這種結構將二氧化碳的固定與卡爾文循環其他反應在空間上被隔開了。葉肉細胞高效吸收外界二氧化碳,再以碳酸根的形式供給維管束鞘細胞進行下面的反應。葉肉細胞成了二氧化碳泵,在它們裏面進行的二氧化碳轉為碳酸根的過程被稱為二氧化碳先固定。而從二氧化碳的先固定到二氧化碳最終在維管束鞘細胞的釋放被稱為哈奇—史萊克循環。過程如下:二氧化碳先與磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶合成草酰乙酸(Oxalacetate),再被蘋果酸脫氫酶轉化為蘋果酸(Malate),蘋果酸會先被保存在葉肉細胞的液泡中,然後再進入維管束鞘細胞中分解為丙酮酸(Pyruvat)和二氧化碳,二氧化碳此時才加入到卡爾文循環中。

觀察上面的過程,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶對二氧化碳的親和力比Rubisco高得多。與C3植物的葉肉細胞要等到結合到大氣中稀薄的二氧化碳才能開始卡爾文循環相比,C4植物的維管束鞘細胞則有了葉肉細胞這個能快速而且密度大的“供貨”上遊,源源不斷地“泵”進二氧化碳,反應自然更高效。即使泵過程耗能,但是C4植物維管束鞘細胞中Rubisco周的二氧化碳濃度從5 µM被提高到 70 µM,高濃度二氧化碳能抑制光呼吸。C3類植物則要花費大量能量進行光呼吸。而在高溫環境下,這種能量節約效果就更明顯了。因為溫度升高,Rubisco的加氧活性上升比羧化提升來得更快。雖然C4類植物在光合作用方面對環境的要求比C3類植物要高,適應性低,但C4類植物的二氧化碳泵機制卻使它們具有很大的生理優勢。

在熱帶地區,太陽入射角大,投影面積小,光通過大氣的路程短,結果是地面溫度高,光強大。C3植物光呼吸強度大,而且會損耗掉卡爾文循環中固定的碳元素的20%,能量損失非常大。加之C3植物要靠頻繁開放氣孔吸收二氧化碳以補償自身Rubisco效能的低下,水分隨著開放的氣孔溢出(蒸騰作用),水分散失自然比C4植物的多。而水份供給又是植物從水生變到陸生之後的生存決定因素。不難理解,C3植物在該地區難以與C4植物競爭。 但是,光照弱的地區,卻很少能見到C4植物(例外:唐氏米草,學名:Spartina townsendii)。光照弱(甚至成為生態學上的限制因素),溫度低,C3植物可以省下二氧化碳前固定的能量,更具優勢。

綜上,將二氧化碳泵機制引入熱帶地區C3類植物,也是改造C3類植物光合效率的壹個方向。

人工控制

有人認為,抑制光呼吸可以提高植物,特別是農作物的碳固定量,從而達到糧食增產的目的。因此科學家們對這方面都作過很多研究,期待有效抑制光呼吸。

基因工程和轉基因技術

該方面的研究焦點是Rubisco。科研人員力求通過改變Rubisco本身結構或其作用環境,以達到提高其在光合作用方向上的專壹性。通過基因工程和轉基因技術的結合,有三種嘗試。前兩種著眼於提高Rubisco的羧化效率,即直接降低加氧酶活性,和通過加入C4旁路的酶提高Rubisco周圍的二氧化碳濃度。第三種方法則是通過控制光呼吸其他的酶以達到降低光呼吸的目的。總體來說,這些方法還沒有取得非常明顯的成果,有時甚至得到負面的結果。

▲嘗試壹

科學家在Rubisco改良方面有三種方向。壹是為植物導入優質的Rubisco。研究發現,紅藻的Rubisco其羧化/氧化專壹性竟是糧食作物的三倍。兩種紅藻Cyanidium caldarium和Galdieria partita擁有的Rubisco,其相對專壹性為高等植物的2.5倍。因此有人將Galdieria partita的Rubisco通過原質體系傳導的方法導入到煙草植物細胞中。然後實驗人員經過壹段時間後測出植物體內該Rubisco大亞基的含量顯著升高,但卻沒有明顯的光合活性提升。原因可能在於煙草細胞中缺乏質粒伴侶素蛋白(Chaperon),這是該Rubisco正確折疊,以及發揮其效能的關鍵。

第二,是直接改造Rubisco。如上所述,Rubisco有8大亞基和8小亞基組成。大亞基包含了催化所需的結構。而小亞基則功能未明。故的科研都比較集中在大亞基上。Rubisco的大亞基上特定區域的氨基酸序列決定或影響了催化速率。但所有在這方面的基因工程試驗都得到了負面結果,即光合效率反而更低。雖然原核生物和真核生物的Rubisco三維結構已了解得比較清楚,但是氨基酸序列,三維結構和催化效能的關系仍未明確。仍沒有壹種比較明確的基因工程策略。隨機突變技術如有性PCR(DNA shuffling)和加速進化都有應用,但是直到今天,仍未有人成功分離出改造成功的Rubisco。

而在小亞基方面,改造工程處於起步階段。有人在突變藍細菌(Cyanobacteria)和綠藻的小亞基基因的試驗後提出,小亞基有可能在提高碳固定效率和區分氧氣/二氧化碳方面有其作用。也有可能,小亞基的基因工程是比大亞基基因工程更可行的改造策略。

第三,是通過激活蛋白改變Rubisco活性。科學家發現Rubisco的活化—失活狀態和壹種叫Rubisco活化蛋白(Rubisco activase)有關,這種蛋白在試管實驗中顯得並不穩定。C3植物在30到35攝氏度的環境下,碳積累能力下降。這個過程是可逆的,就是說只要溫度回落,植物的碳固定能力會恢復。因此有人提出Rubisco活化蛋白與植物光合能力隨溫度起伏這壹現象有關。越來越多文獻支持這壹假設。值得註意的是,C4植物Tidestromia在48°C的環境下才達到其最大光合能力,可能與該植物Rubisco活化蛋白比大部分高等植物的更穩定,更適宜在高溫環境下發揮作用有關。雖然還處在假設階段,但是科學家已著手進行實驗。他們利用基因突變等制造耐熱的Rubisco活化蛋白。在試管中制造出的耐熱Rubisco活化蛋白已能被分離並植入擬南芥中。這些實驗植物在小幅度的提高溫度的條件下,葉面面積是野株的兩倍,光合效率提高30%。雖然這些結果只是初步的,但人們已經看到該方法在提高植物在高溫環境下光合作用所具有的潛力。

▲嘗試二

提高二氧化碳濃度能降低光呼吸強度,正如C4植物的二氧化碳泵所作的。將C4植物二氧化碳泵機制引入C3植物也是的研究方向之壹。其實,早在C4機制被闡明沒多久,就有人致力於將C4植物的優良性狀傳導給C3植物,但是都失敗了。在20世紀末21世紀初,C4旁路中的4種酶都被重組到C3植物中並被成功表達。例如,玉米等C4植物中分離出這些酶的基因就被重組到目標植物大米中。這些基因成功得到高水平的表達。科學家雖然從中觀察到壹些有趣的現象,但是並沒有得到任何專壹性方面的明顯提高。這些酶單壹的高水平表達並沒有明顯影響到大米的生長。而其中NADP-蘋果酸酶的高含量卻會導致植物發育滯脹和葉片變白。很重要的壹點,C4植物的二氧化碳泵機制並不單單是酶的作用結果,還有其解剖方面的結構基礎,即其“花環解剖結構”。而在該方面的科研努力都沒有考慮到這麽壹個重要因素,只是著眼於在C3植物細胞中建立壹套C4植物的酶系統。可見在這個方向的科研上還有很大需要改善的余地。

還有壹種初步成功方法,就是將高度需二氧化碳藍細菌中的ictB基因移植到高等植物中。雖然有人提出該基因具有積累無機碳元素的功能,但是總的來說ictB作用還是未明。科學家已經成功使煙草(Nicotiana tabacum)細胞表達藍細菌聚球藻 PCC7942(Synechococcus PCC7942) ictB基因,並觀察到,煙草在壹定的二氧化碳水平下(但該水平並不是二氧化碳的飽和水平)表現出更高的光合效率。這種結果也在接受了魚腥藻 PCC7120(Anabaena PCC7120)ictB基因的擬南芥被觀察到了。在低濕度環境下,轉基因的擬南芥Arabidopsis thaliana比野株生長更快,幹重更大。這種光合效率的上升和碳盈虧點的下降說明了ictB基因可能在為Rubisco提高二氧化碳濃度方面具有壹定作用。這些實驗的結果說明,為農作物引入ictB基因可能能提高炎熱幹旱地區的農作物產量。將該基因投入商業用途需要壹個前提,就是要明確認識到該基因在細胞中表達的蛋白質在細胞中的位置和作用。

▲嘗試三

第三種嘗試是改變其他參與光呼吸酶的活性以達到抑制光呼吸的目的。這可以通過基因工程或添加光呼吸抑制劑達到。關於光呼吸抑制劑請見後。

這種嘗試是建立在化學平衡的理據之上:壹個化學反應A→B,反應初,A的濃度大,不斷轉變為B。但B會通過逆反應返回A,只是開始的時候B的濃度比A低得多,反應趨勢是A到B。但如果B的濃度足夠大,B到A的反應發生得和A到B壹樣頻繁,反應在宏觀上就被停止了。

再觀察反應鏈A→B→C。如果B→C很慢,甚至被抑制,B的濃度就會很高。A→B之間的反應就不能進行,只能維持在平衡狀態。

這種嘗試試圖解決能量,RuBP和NADPH在光呼吸途徑上被浪費的問題。但是中間產物會因反應不能進行而被堆積,會對細胞造成損害。

試驗證明,通過基因改造抑制了某些參與光呼吸的酶的植物,無法在正常空氣中生長。在反義植物中,甘氨酸脫羧酶的活性被壓制,會導致植物日間甘氨酸水平高於野株100倍,進而出現光合速率降低和生長速度放慢。壹些植物,其絲氨酸羥甲基轉移酶(serine hydroxymethyl transferase SHMT)的活性降低則會更明顯的影響植物的生長,特別是在高光照環境下。絲氨酸羥甲基轉移酶活性被嚴重降低的植物無法在正常空氣中生存,甚至在壹般光照下也不行,但是卻能在高二氧化碳的環境下生存。

提高二氧化碳分壓及降低氧分壓

如上所述,Rubisco的羧化酶/加氧酶活性受到所處大氣二氧化碳和氧氣的分壓比例影響。同樣是21%的氧氣,在伴有300 μl/l CO2的情況下,光合作用效率會下降41%,其中三分二是因為氧氣爭奪Rubisco中心造成的,而另外三分壹則是光呼吸損耗造成的。當二氧化碳濃度再下降到50 μl/l時,光合作用效率則會下降92%,此時,三分之二的損失卻是由光呼吸造成的。

因此人為地提高Rubisco周圍二氧化碳/氧氣分壓比例是抑制光呼吸壹個快速有效的方法。在生產方面,在溫室或大棚等封閉的系統中,可以應用幹冰,或某些化學反應以提高空氣中的二氧化碳濃度。而在露天的大田則應該註意風向的選擇,保證通風良好,並且適當施加有機肥料,如碳酸氫銨,以增加土壤的二氧化碳釋放率。據測定,缺乏腐殖質的土地二氧化碳釋放率為2千克/畝·小時,相對的富含腐殖質的土地,二氧化碳釋放可達4千克/畝·小時。全球氣候變暖,二氧化碳的濃度在過去兩三百年內因為工業的發展在穩定上升,到2050年時,二氧化碳會到達550ppm水平。從全球的角度來看,糧食產量可能會因為光呼吸的抑制而增加。但這個效應應該結合臭氧和其他氣候因素綜合考慮。

使用光呼吸抑制劑

乙醇酸是光呼吸過程中第二個產物,科學家通過某些化學制劑可以抑制其產生,使得光呼吸的後續反應無法進行下去,從而達到抑制光呼吸的作用。主要的光呼吸抑制劑有以下幾種:

①α-羥基磺酸鹽,能抑制乙醇酸氧化酶的活性,乙醇酸的氧化過程受阻,後續反應減慢,另壹方面這會造成乙醇酸濃度的上升,在1,5-二磷酸核酮糖→乙醇酸的反應中,反應平衡往反應物方向移動,光呼吸被抑制。但是值得註意的是,當經過壹段時間後,植物固碳效果並不顯著提升,估計是由於積累起來的乙醇酸對植物造成毒害作用而致的。

②亞硫酸氫鈉,同樣是作用於乙醇酸氧化酶。以100mg/L 的亞硫酸氫鈉噴灑大豆葉片,1到6天內,光合速率平均提高15.6%,光呼吸被抑制達32.2%。

③2,3-環氧丙酸,有人認為其會作用於谷氨酸-乙醛酸轉氨酶,達到抑制光呼吸的目的,但並未得到廣泛證實。

需要註意的是,大多數有關光呼吸抑制劑的數據都來自於實驗室,並未得到廣泛的應用和證實,而且科學家還未能找到壹種不具副作用的Rubisco加氧酶特異抑制劑。

選用低光呼吸作用作物

不同的植物,其光呼吸的強度也不壹樣。C3類植物,如大多數樹木,大豆,煙草屬於高光呼吸植物類型,光合速率較低。相對於高光呼吸植物,C4類植物的光呼吸可以說被完全抑制,如甘蔗和玉米。在高等植物中發現的專壹性最高的Rubisco存在於糧食作物中。根據在地中海地區對24種C3類植物的Rubisco研究,科學家得出結論,生活在炎熱,幹燥和高鹽環境中的植物,其Rubisco專壹性較高。補血草屬植物(Limonium)擁有的Rubisco專壹性超過了很多農作物,而其中的壹種Limonium gibertii更是該次研究的專壹性冠軍。理論上,可以通過雜交或分子生物學技術改造農作物光呼吸方面的屬性,提高產量。

正面效應

對於C3類植物來說,光呼吸就如壹個活塞。當外界氣溫升高,而植物氣孔需要關閉來防止過多水分的流失時,葉中的二氧化碳濃度會降低,這導致碳反應的停滯。碳反應不能及時消耗多余的能量ATP,這導致在光反應中單態氧出現機率增大。而單態氧非常活潑,會對葉細胞的光合作用器進行廣泛的破壞。對於轉基因植物和插入突變株的研究表明,光呼吸是植物在有氧環境下必須的生化過程。總結來說,植物在高光照,幹旱和高鹽等熱帶環境下會發生光抑制,而光呼吸則很可能是減輕其影響的機制。

測定方法

壹般的氣體交換方法不能測出光呼吸的二氧化碳/氧氣使用情況。可用的方法有如下幾種:

①對植物進行光照,突然停止,這時會發生所謂的“二氧化碳猝發”,其速率可代表植物光呼吸的速率。

②先讓植物在低氧環境下進行光合作用,此時光呼吸不能進行。在將植物植物置於大氣中,可根據兩種狀態之間的差異推算光呼吸的速率。

③用具有碳14同位素的二氧化碳供應植物進行光合作用。然後在暗室向植物通入不含二氧化碳的空氣,測定其呼吸情況壹次。再在光照條件下測定壹次。可根據兩次之差進行推算。

④將二氧化碳與光合速率關系曲線移動至二氧化碳為0,光合速率為負的位置,即可讀出光呼吸速率。

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