電影設定於第二部劇情發生的三年後，彼得·派克繼續蜘蛛俠英雄使命時，其戀人瑪莉·珍·沃森則繼續她的演藝事業，昔日摯友哈利·奧斯本變成新壹代綠魔，開始追殺彼得來為父報仇。電影同時首次介紹兩位蜘蛛俠的新敵人：沙人和毒液：致命守護者，同時介紹蜘蛛俠的另壹名戀人格溫·斯黛西。
劇情：彼得·派克自從被戀人瑪莉·珍·沃森發現自己的“蜘蛛俠”身份後，如今跟她交往三年而準備向她求婚。就在瑪莉·珍剛在百老匯劇院初演完成後，彼得和她在中央公園裏賞流星雨時，未註意到壹顆小型隕石落至他們附近。
與此同時，壹位剛越獄的逃犯佛林特·馬可，回家見他身患絕癥的女兒潘妮壹面，隨後繼續逃亡卻不慎掉進實驗重地，受粒子加速器實驗影響而身體發生分解，跟周圍的沙子融合後變成能自由變形的“沙人”。
後來，格溫的父親兼紐約市警察隊長喬治·斯黛西向彼得和梅嬸匯報說，馬可才是五年前搶車並槍殺班叔的真兇，而搶錢的丹尼斯·卡雷汀只是幫兇。憤怒的彼得收聽警用頻道追尋馬可過程中，***生體偷偷爬入穿著蜘蛛俠戰服的彼得身上，跟其混合後將戰服變為黑色並增強彼得的實力。
然而，***生體同時黑化彼得的善良心靈，使他著裝黑戰服跟著搶完錢的馬可至下水道。得知水是馬可的弱點後，彼得打開水管將馬可分解並沖走，認為他已為班叔報完仇。
瑪莉·珍的演藝事業剛好壹落千丈，失落的她找出院的哈利獨處乃至親吻，最後她不想背叛彼得而離開。受愛情打擊的哈利因此恢復記憶，在父親幻覺督促下繼續他的復仇，以彼得的性命來威脅瑪莉·珍忍痛跟他分手。在聽完瑪莉·珍分手是因為“愛上某人”後，彼得發現是哈利搞鬼而換上黑戰服，跑到哈利的頂層公寓壹決高下。
後來，他來到報社以確鑿證據公開艾迪的造假行為後，總編J·喬納·詹姆森憤怒地將艾迪開除，壹切順心讓彼得認為這件黑戰服是天賜。同時，馬可成功克服怕水弱點，存活下來並逃出下水道。為了讓瑪莉·珍嫉妒，彼得將格溫約至瑪莉·珍如今工作的夜間俱樂部，當格溫領略到彼得的企圖後便離開，而彼得因為在夜店裏的小爭執，無意間打到瑪莉·珍。
彼得霎那間發現自己變得殘暴無常，在教堂頂上為了擺脫***生體，利用教堂鐘聲的強大聲波來幹擾***生體且將其撕下來。這時，身敗名裂的艾迪來到教堂裏祈禱能殺死彼得時，聽見彼得的喊聲後來到鐘下方，不僅註意到彼得是蜘蛛俠、還跟落下來的***生體融合後變成邪惡的“毒液：致命守護者”。艾迪隨後找到馬可來提出合作，殺死蜘蛛俠來達到各自的目的，他隨後綁架瑪莉·珍、在壹座建築工地高樓上布下黑色蜘蛛網，而底下由變成沙子巨人的馬可負責看守。
由於哈利拒絕幫他，彼得只好獨自上陣，在壹對二的情況下完全不敵並幾乎被打死。這時，哈利從曾經處理過父親遺體的管家伯納德口中得知，自己父親死因其實是咎由自取，在覺醒之下搭滑翔翼前來為彼得助陣。彼得對抗毒液：致命守護者途中，哈利成功用導彈制伏馬可，隨後跟彼得壹起救下瑪莉·珍。
但二人面對毒液：致命守護者仍處於下風，當毒液：致命守護者準備拿哈利的滑翔翼刀刃刺向彼得時，哈利犧牲自己跳過去擋下刀而受致命傷。彼得找準時機用多數鐵柱將毒液：致命守護者罩住，通過敲打聲波來讓艾迪脫離***生體，當彼得拿出南瓜炸彈扔向毒液：致命守護者時，艾迪不情願讓它毀滅而自行跳過去，最後壹起跟***生體炸成灰燼。
恢復人形的馬可上前對蜘蛛俠坦述五年前的實情，解釋班叔在他搶車時其實曾經勸過他住手而使他壹度動搖，後來被搭檔丹尼斯推壹下導致手裏的槍意外走火才殺死班叔。馬可表示他五年下來都因這件事飽受煎熬，彼得決定原諒馬可的罪行後，讓馬可化為沙子離去。
重傷的哈利臨死之際，跟彼得釋盡所有前嫌後最後證明他們的友情，最後死在彼得和瑪莉·珍面前。事情之後，哈利被譽為英雄後被安葬，彼得、瑪莉·珍、梅嬸、格溫和管家伯納德等人均出席。葬禮過後，彼得和瑪莉·珍在夜店裏正式和解，兩人跳著舞並相擁。