本次課程的內容分三大部分：
質譜儀的原理、使用與維護
納升型液相色譜儀的使用與維護
生物質譜運行狀態的評估
液相色譜儀
1906年，壹位叫Tsweet的俄國科學家，發現了這麽壹個現象：在壹個玻璃管裏放了壹些碳酸鈣的粉末，也就是石灰粉，然後把胡蘿蔔搗碎後的石油醚提取液加到柱子裏，隨著石油醚的流動，他發現在柱子上形成不同的色帶，其實就是胡蘿蔔裏包含的各種色素在碳酸鈣柱子裏被分離開了。由於觀察到不同的色帶，所以他管這種現象叫色譜。
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我們通過下面的示意圖來理解壹下這個現象的原理。胡蘿蔔提取液中含有不同的色素，柱子上的碳酸鈣會對這些色素產生形成吸附作用，而不同的色素，因為理化性質不同，則與碳酸鈣固定相的吸附作用力也不同。吸附力強的色素，在裏面停留的時間就會長壹些，比如說圖中的黃色物質，它是最後被洗下來的，而吸附力弱的色素，比如綠色的物質，就很容易被石油醚沖下來，所以它第壹個被洗脫。
所以色譜分離的原理就是利用待分離物質與固定相（比如上例中的碳酸鈣柱子）和流動相（比如用來沖洗色素的石油醚）之間相互作用的差異來實現分離。
根據相互作用類型的不同，色譜法又可以分為：
--吸附色譜法：物理吸附法
--分配色譜法：根據溶解度的不同，卻多肽疏水性的差異
--離子交換色譜法：根據多肽等電點的差異，依靠陰陽離子相互作用
--尺寸排阻色譜法：根據分子尺寸和分子量的不同
--親和色譜法：利用抗原抗體和其它特異性作用
目前，在蛋白質組學研究中，用得最多的就是分配色譜法，就是根據樣品在固定相與流動相之間溶解度的差異來實現多肽或蛋白的分離。實際上是利用了多肽或蛋白疏水性上的差異。
說到這裏，問題就來了：在上壹個例子中，固定相是碳酸鈣粉末，是固體，那麽蛋白或者多肽怎麽可能會溶解到固體中去呢？
這裏我們需要解釋壹下液相色譜的固定相。我們用的反相液相色譜的固定相叫做鍵合多孔矽膠。如果在電鏡下將這種材料顆粒放大，就能看到它的表面是壹種多孔的結構，長得有點像核桃的表面。
它的表面並不是純粹的二氧化矽，而是通過化學修飾的方法，鍵合上去壹些C18（十八烷基矽烷）。比如下面這個反應的示意圖：
矽膠的表面是二氧化矽，水化之後形成矽羥基，然後通過化學反應，把圖中含有Si, Cl, C的化合物結合到二氧化矽上去，形成長鏈烷烴的結構。長鏈烷烴其實就是壹種油，通過這種化學反應，相當於在二氧化矽的表面塗上了壹層油膜，只不過這不是簡單的塗抹，是“化學塗抹”，連接上去的油層是很穩定牢靠的。於是，多肽就可以溶解在這層穩定的油膜裏。所以，對於疏水性更強的多肽，更容易溶解在油膜裏，親水性強的多肽，則不容易溶解在油膜裏，於是就實現了不同極性多肽的分離。
這種顆粒有多大呢？我們常用的液相色譜填料的顆粒直徑是在1.7μm - 5μm之間，是非常小的，與之前Tsweet例子裏用的碳酸鈣粉末完全不在壹個數量級上，碳酸鈣粉末顆粒的直徑是在100μm-200μm之間。
明白了液相色譜的原理以後，我們來學習壹下它的構成，主要有四個部分：
色譜儀組成
1、 色譜柱：玻璃柱+固定相
2、 流動相輸送系統：對於Tsweet那個實驗，沒有專門的輸送系統，是靠重力使得樣品流過固定相。對於現在的實驗來講，我們用的色譜柱填料是非常細的，只有壹點幾微米到幾微米，這時候靠重力是很難讓流動相流下來的，而是需要用壹個泵來把流動相擠壓下去。所以液相色譜要配壹個泵系統，來輸送流動相。
3、 進樣系統：對於Tsweet實驗，只需要用手把樣品倒進柱子裏，就算進樣了。而現在我們都是用密封的系統，需要壹個自動進樣器來完成。
4、 檢測系統：現在常用的有紫外或熒光，最簡單的就是用肉眼來觀察是否有樣品流出。
壹個液相色譜儀，通常就是由這四個模塊組成。我們來看下面兩個實物圖。左邊是戴安的液相色譜儀，從上往下依次是泵系統、進樣系統、柱系統和檢測系統，右邊是Waters的液相色譜儀，也是類似的結構。
對於我們蛋白質組學領域，常用的液相色譜儀是納升液相色譜。它與普通的液相色譜最大的區別就在管子的粗細和流速上。下圖是納升液相色譜的管路和接頭與常規液相色譜的比較。
首先，從外觀上我們也能看出很大的不同。常規液相色譜的柱子內徑是在1-5mm，而納升液相色譜柱子就細了很多，與連接的管路粗細幾乎是壹樣的，看上去就像壹根線。加上外面的保護皮，這根線的外徑也只有360μm，如果把保護皮扒掉，外徑大概只有110μm-120μm，內徑只有50μm。與常規的液相色譜柱相比，相當於把柱子的直徑縮小了20-100倍。
當我們把柱子的內徑縮小了20-100倍以後，流動相的流速也相應地變緩了很多。常規液相色譜的流動相流速通常是在0.2-1ml/min，而納升液相色譜卻只有50-300nL/min，這與常規液相色譜的流速比，下降了1000倍。
那麽，為什麽我們需要將流速下降1000倍呢？要回答這個問題，我們先來看看下面這張納升色譜與常規色譜靈敏度的對比圖。
我們分析2 pmol的肌紅蛋白酶解產物，在不同直徑的柱子中的靈敏度。比如，在4.6mm的柱子裏，流速為1ml/min，我們幾乎是看到紫外信號的；當我們把色譜柱逐漸縮細到1mm、300μm，直到180μm的時候，我們就可以看到非常清晰的紫外吸收峰，也就是酶解產物的譜圖。
為什麽會出現這種現象呢？
我們來回顧壹下，當常規液相色譜的流速是1ml/min時，也就是說，我的樣品會被1mL/min的液相所稀釋，而當我們用納升液相色譜時，我們會把流速降到300nL/min，相比於1mL/min，流速下降了3000倍，也就是說，樣品被變相地濃縮了3000倍。由於樣品的濃度被變相提高了很多，所以檢測的靈敏度也就相應提高了。
這就是為什麽我們要使用納升液相色譜，就是為了減少樣品被流動相稀釋的倍數，從而提高檢測的靈敏度。
那麽，納升液相色譜儀從外部看，有什麽特點呢？其實它與常規液相色譜儀使用的泵都是壹樣的，但是管路這部分是不同的。下面是壹個實物圖，右側的局部圖展示的是流量控制器，進樣的管路還是跟常規管路壹樣，是100mm的內徑，而流出的管路外徑就變成了180μm，內徑只有50μm，用了非常細的色譜柱，可以縮減流動過程中體積的延遲，或者梯度的延遲。
Tips
梯度延遲是指梯度洗脫時色譜泵改變梯度後，色譜柱感受到這個變化所需要的延遲時間。常規液相色譜的梯度延遲約100-400微升，0.2-0.5 min，納升液相色譜約1-5微升，5-15分鐘。
介紹完液相色譜儀，我們再進壹步說說，它是怎麽與質譜儀聯用的。
液質聯用技術
實際上，對於蛋白質組學研究來說，液相色譜和質譜是不能單獨工作的，它們必須聯機工作，才能實現對蛋白質的檢測。那它們是怎麽實現聯機的呢？可能妳會說，弄個接口連起來唄！我也覺得這是最直接的解決方案，但問題是，需要什麽樣的接口？
要回答這個問題，我們先來看看將液相色譜和質譜連接起來，需要面對哪些挑戰？液相色譜儀是在常溫常壓下工作的，柱子是放在空氣中運行的，而且樣品是溶解在流動相（水或有機溶劑）當中的。而質譜儀需要在真空環境下工作，樣品需要從溶液狀態轉化為氣態，而且需要被電離。所以總的來說，我們需要壹個電離源，能把樣品從常溫常壓的液相狀態直接變成真空中的氣態離子狀態。
我們再來梳理壹下這個電離源需要具備的功能：
電離源功能
功能壹：去溶劑和氣化，把樣品中的溶劑去掉，將待檢測的多肽分子變成多肽的氣態分子；
功能二：將多肽的氣態分子離子化，讓它們帶上電荷；
功能三：把多肽的氣態離子送到真空當中。
僅用壹個電離源，就能同時實現這麽多的功能？聽上去貌似是件很難完成的任務！然後，就有這樣壹種技術被機智的人類發現了出來，很好地實現了上述功能，它就是ESI，即電噴霧電離！順便說壹句，這個技術的發明者，John Fenn，在2003年獲得了諾貝爾化學獎。
ESI的主要原理是這樣的：樣品首先通過壹個毛細管噴針，被噴出來，進入質譜儀。而在噴針的外面，會用壹個鞘氣（sheath gas）來輔助樣品的霧化。這其實跟我們用的噴霧器或者噴壺是非常相似的道理。如果壓噴壺，噴壺裏的氣或者水就會噴出來。
但是噴出來這壹步，只能解決樣品的霧化問題，樣品實際上還是溶解在流動相中的。所以我們會對鞘氣進行加熱，當加熱的鞘氣吹到樣品中或者溶液中時，溶液中的流動相或者溶劑就會揮發，就會剩下氣態的離子。
同時，在毛細管噴針尖端與質譜儀的入口之間，還會加壹個電壓，叫High voltage，對這些待電離的分子，首先溶劑揮發掉，然後分子被氣化，最後在電場的作用下，分子就會變成離子，實現電離的過程。然後，這些離子會被質譜儀入口處的真空抽到質譜儀裏，同時被電場驅動進入質譜儀。於是，就實現了氣化、電離以及真空過渡三重需求。這就是液相色譜與質譜的接口，即ESI電噴霧電離。示意圖如下：
對於蛋白質組學研究來說，由於我們前面分離樣品的時候使用的是納升液相色譜，所以ESI電離源也需要做適當的改進，來適應納升液相的特點，這種ESI我們叫做nanoESI，即納升電離源。
對於普通的電離源，當使用鞘氣的時候，電離源可以承受的流速通常是在0.1mL/min – 1mL/min，而納升電離源的流速只有100-500nL/min，這種超低流速下我們已經不需要用鞘氣來輔助噴霧，只需要依靠樣品自身的揮發，以及樣品的噴針針尖與質譜儀入口的電壓差，就可以實現穩定的噴霧。也就是說，在這種情況下，我們只需要把噴針針尖的開口做得非常細（通常開口內徑是在3-10μm），並且只需要1.5 -2.5kV的電壓，就可以實現連續穩定的噴霧。
樣品通過這個噴針出來以後，就會發生霧化氣化，溶劑蒸發掉，然後樣品發生電離，進入質譜。下面就是nanoESI的實物細節圖，右下角就是噴針的特寫照。