就商品及服務稅下拉試驗的細節征求意見

GST下拉實驗是壹種驗證酵母雙雜交系統的有效體外檢測技術，近年來受到越來越多學者的青睞。其基本原理是將靶蛋白-GST融合蛋白親和固定在谷胱甘肽親和樹脂上，作為壹種“誘餌蛋白”作為與靶蛋白親和的支持物。目標蛋白溶液通過柱子，從柱子上可以捕獲相互作用的“捕獲蛋白”(目標蛋白)，結合物被洗脫，用SDS-PAGE電泳分析，從而確認兩種蛋白之間的相互作用或篩選相應的目標蛋白，“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”。該方法簡單易行。GST:谷胱甘肽S-轉移酶的分子克隆，第三版，詳細介紹。很容易理解，GST融合蛋白沈澱技術是利用GST對谷胱甘肽偶聯珠的親和力，從非相互作用蛋白的溶液中純化出相互作用蛋白。從細菌中表達和純化GST融合的探針蛋白，並平行制備細胞裂解物(其可以被35S標記或未標記)。然後將GST融合的探針蛋白和細胞裂解物混合，並在Gu-Gu-Gan-Fu瓊脂糖珠存在下溫育，以結合蛋白。通過離心收集GST融合探針蛋白和任何結合分子，並將獲得的混合物洗滌，用過量遊離粘性膠洗脫或直接在SDS-PAGE加載緩沖液中煮沸。通過SDS-PAGE分離蛋白質，並通過蛋白質印跡、放射自顯影和蛋白質染色進行分析。GST沈降技術對於檢測溶液中的蛋白質相互作用特別有用，這在膜分析中可能檢測不到。GST沈降實驗通常有兩個應用:確定融合(或探針)蛋白和未知(或靶)蛋白之間的新相互作用(Kaelin等人1991，grlinick和Chao 1996)，以及確認探針蛋白和已知蛋白之間的可疑相互作用(參見Posern等人199 $，Grgureaich等人1999，Hunter等人65438+這兩個實驗的設計和實現是不同的。？目的:在體外檢測蛋白質與蛋白質的相互作用。用於驗證兩個已知蛋白質之間的相互作用，或者篩選與已知蛋白質相互作用的未知蛋白質。實驗原理:探針蛋白通過重組技術與GST(谷胱甘肽s轉移)融合，融合蛋白通過GST與固定在載體上的GTH(谷胱甘肽)親和結合。因此，當與融合蛋白相互作用的蛋白通過層析柱或與固體復合物混合時，可以被吸附和分離。試劑:NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、Triton-100、IPTG(默克)、PMSF(阿默斯科)、科克泰爾(默克53965438+)。固定化谷胱甘肽(Pierce 15160)實驗操作規程:材料和試劑:融合GST的原核蛋白、裂解細胞蛋白或組織蛋白提取液。

細胞蛋白裂解液，洗脫液:PBS和PBS+1% Triton-100 PBS(1L)NaCl:8g KCl:0.2g na 2 hpo 4:1.44g kh2po 4:0.24g加入800ml蒸餾水，用HCl調節溶液pH值至7.24g。4℃保存備用！PMSF(芐基磺酰氟)MW:174.19工作濃度為0.1-1mM，其中使用1mM，儲存濃度為100mM，0.174g PMSF PMSF溶於65438+。-20℃或4℃保存(以下流程僅用於研究已知的原核蛋白A與真核過表達蛋白B的相互作用)1:獲得原核融合蛋白A 1.1:將編碼蛋白A和GST的重組體漿化成BL21(DE3)。菌株1.2:挑取單個克隆置於含5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml試管中，37℃培養過夜1.3:將培養液轉移至含500ml LB(+100ug/mlAmp)的100ug/mlAmp中。225rpm培養至OD600≈1.0-1.5，加入適當濃度的IPTG，在適當的溫度下培養適當的時間(誘導條件需要根據不同的蛋白進行調整)6000 g，10分鐘，4℃離心收集菌體，去除上清液，將菌體置於-20℃。立即放在冰上，每500ml培養液加入10-20ml細菌裂解液(PBS+1% Triton-100+PMSF)，吹混均勻1.5:冰上超聲破碎，啟動2秒，停止9秒，共40-60分鐘。直到裂解液充分冷卻，1.6: 11000轉/分，15分鐘，4℃離心上清液，-80℃保存備用。2.獲得真核融合蛋白b

2.1:將編碼B蛋白的堿基序列克隆到編碼tag蛋白的真核表達載體(如HA或myc)中，3: 48小時後用XQ轉染細胞，在冰上凍融適量的融合蛋白GST-A 4:將50-70ul GST-珠(固定化谷胱甘肽)放入EP管中，用800 ul PBS+1% Triton-100洗滌壹次，混合冷凍的融合蛋白GST-A5:PBS+1% Triton-100 3次，PBS 3次。留下20ul(PBS+珠子)作為報價。6.同時裂解真核融合蛋白B，耗盡培養基，用PBS(RT)洗滌壹次，加入300ul裂解液(以6孔為例，PBS+1% Triton-100+cock taier)，4℃靜置30分鐘。7:吹集至1.5mlEP管，超聲粉碎。65438±03000轉/分，65438±05分鐘，4℃離心取上清液。8: BCA蛋白定量(可選)留下20ul作為報價，將剩余的樣品加入到純化蛋白的EP管中，用PBS將液體補足到600ul左右，使蛋白充分結合！4℃旋轉結合O/N9:PBS+1% Triton-100 3次，PBS 3次。10: 40UL 5×上樣緩沖液將蛋白溶解在珠子上，煮沸3分鐘，高速離心，在Run -SDS PAGE上進行Western Blot檢測。使用HA或myc印跡。註意GST的對比——下拉。(以A-GST和B-6*His為例)1。運行SDS-PAGE時，用壹個輸入蛋白(即B-6*His)作為陽性對照，看看在western操作時，試劑和操作步驟是否有問題。2.只有GST蛋白，輸入B-6*His，用作陰性對照，觀察GST是否會與輸入的蛋白相互作用。免疫沈澱或GST-下拉1的方案。用冷PBS洗滌細胞單層壹次。2 .用2mM 3，3’-二硫代二巰基琥珀酰亞胺丙酸酯/PBS在4？以交聯相關的蛋白質。(可選)3 .刮掉電池，旋轉到4？以1000轉/分的轉速運轉5分鐘。4.傾析上層清液。5.將細胞沈澱重懸於適量IP-緩沖液A中，40%超聲處理

輸出10秒，並在4 ℃?持續45分鐘。6.以最高速度旋轉4？持續5分鐘。7.回收上清液並用布拉德福德試劑(Bio-Rad)檢測蛋白質濃度。8.取500ug蛋白質，與4倍體積的IP-緩沖液b混合。通過添加1ug正常IgG和5ul蛋白-G珠(適馬)對裂解物進行預凈化，在4？c為1小時。對於GST-下拉分析，添加1ug GST蛋白和5ul谷胱甘肽-瓊脂糖4B珠。10.在4點旋轉珠子？c在10000轉/分下持續3分鐘。11.回收上清液，加入1ug特異性抗體或正常IgG，並在旋轉器上於4？持續2小時。對於GST-下拉分析，添加1ug GST融合特異性蛋白或等摩爾的GST蛋白。12.加入5ul 5ul protein-G或谷胱甘肽-sepharose 4B珠，再孵育2小時或過夜。13.在4點旋轉珠子？以2000轉/分的轉速運轉3分鐘。註意:在管壁上的珠子上方會有壹些白色顆粒，這是由於變性引起的蛋白質沈澱。除去這些沈澱物，否則它們將在對照組和試驗組中產生錯誤的結合帶，影響對結果的解釋。在每個洗滌步驟中檢查這種現象。14.用1毫升IP洗滌緩沖液在旋轉器上以4？持續5分鐘。15.在4點旋轉珠子？以2000轉/分的轉速運轉3分鐘。16.重復步驟14和15三次以上。17.將沈澱重新懸浮在25ul 1xSDS上樣緩沖液中，並在室溫下孵育30分鐘。18.在室溫下以3000轉/分的速度旋轉5分鐘。19.回收上清液並置於–20？或進行SDS-PAGE電泳。20.對於輸入對照，凝膠運行中將包括25ug蛋白質。註意:為避免IgG重鏈對分子量在50KD左右的特異性蛋白的幹擾，可改用不含β-巰基乙醇或DTT的1x SDS上樣緩沖液。在這種條件下，鏈間半胱氨酸-半胱氨酸鍵將被保持，產生100KD左右的IgG帶。IP-緩沖液A:50mm Tris-Cl PH 7.5 150mm NaCl 1mm EDTA PH 8.0 0.5% Triton X-100 plus蛋白酶抑制劑(Roche)IP-緩沖液B:IP-緩沖液A減去Triton X-100。IP洗滌緩沖液:50mm Tris-Cl PH 7.5 150mm NaCl

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